题目：Characterization of three positive regulators of tetramycin biosynthesis in Streptomyces ahygroscopicus
期刊：FEMS Microbiology Letters
影响因子：1.765
影响因子：1.765
合作技术：EMSA
研究背景
放线菌在生长的过程中会产生较多的次级代谢产物，这些次级代谢产物合成与细胞的分化有着密切的关系，同时这些代谢产物的调控也受到各方面因素的调控。
本文先对氨基酸序列、结构域分析以及同源比对的方法锁定LAL家族3个正调控子ttmRI、 ttmRII、ttmRIII 。再通过同源重组的方法缺失这三个基因，并观察基因缺失后对放线菌的次级代谢产物、菌体的生长形态的影响，最后结合RT-PCR民和EMSA结果发现，3个调控基因存在互相调控和自身调控现象，说明四霉素生物合成中存在复杂的调控网络，对四霉素的生物合成进行严格调控。本文对四霉素生物合成调控基因的功能分析，丰富了对抗生素生物合成调控的认识。
研究内容及结果
通过蛋白结构域分析、氨基酸序列比对以及蛋白质二级结构的模拟，初步判断ttmRI、 ttmRII、ttmRIII 3个基因属于正调控基因，且3个蛋白的N端均含有NTP结合区域的保守序列WalkerA（GPxGxGxx）和WalkerB（LxxVDD），Ｃ端含有螺旋－转角－螺旋结构（HTH结构，DNA结合区域）的保守序列GlxnxxIAxxLxVSxrxVExHLTxxxyRKLxV，属于LAL家族调控蛋白的特征结构；另外，以上3个蛋白内部均含有与蛋白相互作用相关的TPR结构。
通过同源重组的方法分别敲除ttmRI、 ttmRII、ttmRIII三个基因，得到三个基因的缺失株。并通过PCR的方法检测基因敲除成功。
敲除ttmRI、 ttmRII、ttmRIII后，发酵产物中四环素A、四环素B的的产量相对于出发菌株（H42）来说，会相应的减少。ttmRI、ttmRIII基因只是影响次级代谢产物的形成，而并不会影响菌株的生长及菌体分化，ttmRII对菌落抱子色素合成有一定的影响。
对基因簇中的20个基因做QPCR检测，结果显示除ttmD 和 ttmL.两个基因未下调外，其他基因在不同程度上均受到不同程度的抑制。说明LAL家族ttmRI、 ttmRII、ttmRIII调控子直接或者间接调控上述基因的转录。
为进一步验证ttmRI、 ttmRII、ttmRIII调控子作用与上述基因的机制，对三个调控子的主要的结构域截短后在大肠杆菌中进行表达纯化。用表达纯化的结构域与上述基因的启动子在体外进行EMSA实验检测，以验证ttmRI、 ttmRII、ttmRIII对基因的调控是直接作用还是间接作用。实验结果显示：ttmRI对ttmKp, ttmGp, ttmS1p, ttmRIVp, ttmRIp， ttmJ-A有直接调控；ttmRII对ttmGp, ttmRIVp, ttmRIp有直接调控；ttmRIII对ttmEp, ttmGp, ttmS1p, ttmRIVp, ttmRIp， ttmJ-A有直接调控。
链霉菌中四霉素的生物合成被基因簇内3个调控基因组成的复杂网络所调控，3个调控基因调控范围既有重叠又有差异，同时还存在互相调控及自我调控的现象，从不同方向看各调控子在调控网络中所处的等级不同。
从ttmR阻断株中四霉素产量看，缺失ttmRI四环素产量最高，说明ttmRI对四霉素生物合成调控能为最弱。从调控基因的调控作用范围来看，ttmRII基因除了通过调控功能基因转录来控制四环素合成之外还对还对菌落抱子色素合成有影响，而ttmRI、ttmRⅢ仅调控四霉素的生物合成。从调控子对各基因转录的调控作用来看，ttmRI、 ttmRII、ttmRIII成的转录单元的转录受其本身调控。
文章小结
1. 成功的构建了ttmRI、 ttmRII、ttmRIII三株缺失株。
2. 四霉素生物合成基因簇中存在3个正调控基因ttmRI、 ttmRII、ttmRIII调控，三个基因均属于LAL家族调控子，其中ttmRII还对抱子色素具有调控作用。
3. 在四霉素生物合成时，调控子ttmRI、 ttmRII、ttmRIII形成复杂的调控网络。
4. 分别在出发菌株中增加3个调控基因拷贝数，增加ttmRI、 ttmRII、ttmRIII时，四霉素产量反而下降，且増加的拷贝数越多四霉素产量越低。这说明不吸水链霉菌中可能存在ttmRI、 ttmRII、ttmRIII的浓度界限，当调控子浓度高于这个浓度会导致四霉素产量降低。
解析文献
Hao Cui , Shoujia Liu , et al(2016). Characterization of three positive regulators for tetramycin biosynthesis in Streptomyces ahygroscopicus. FEMS Microbiology Letters. 61:123-154
Hao Cui , Shoujia Liu , et al(2016). Characterization of three positive regulators for tetramycin biosynthesis in Streptomyces ahygroscopicus. FEMS Microbiology Letters. 61:123-154
参考文献
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2. Arias P, Fernández-Moreno MA , Malpartida F (1999). Characterization of the pathway-specificpositive transcriptional regulator for actinorhodin biosynthesis in Streptomyces coelicolor A3(2) as aDNA-binding protein. J Bacteriol 181: 6958–6968.
3. Burg RW, Miller BM, et al (1979). Avermectins, new family ofpotent anthelmintic agents: producing organism and fermentation. Antimicrob Agents and chemother 15:361-367.
4. Cao B, Yao F, et al(2012). Genome mining of thebiosynthetic gene cluster of the polyene macrolide antibiotic tetramycin and characterization of a P450 monooxygenase involved in the hydroxylation of the tetramycin B polyol segment. ChemBioChem 15:2234–2242.